厭氧菌是地球上數(shù)量***多、物種***豐富的微生物，也是分類(lèi)上報(bào)道***少的微生物。它們對(duì)氧氣敏感、生長(zhǎng)條件苛刻，不容易培養(yǎng)分離。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了厭氧微生物的研究歷史，分析了限制厭氧微生物培養(yǎng)分離的主要因素，討論了厭氧微生物培養(yǎng)分離的策略和方法，回顧了國(guó)內(nèi)外厭氧微生物的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)現(xiàn)狀，并展望了厭氧微生物培養(yǎng)分離的發(fā)展趨勢(shì)。

　　根據(jù)微生物對(duì)氧氣的利用和耐受程度，科學(xué)家曾經(jīng)將它們分為好氧、微好氧、嚴(yán)格厭氧、兼性厭氧和耐氧微生物(表1)。厭氧微生物無(wú)法在有氧條件下生長(zhǎng)。兼性厭氧微生物在有無(wú)氧條件下都可以生長(zhǎng)繁殖。耐氧微生物則能夠在厭氧條件下生長(zhǎng)，也能耐受一定濃度的氧氣。過(guò)去認(rèn)為氧氣濃度達(dá)到巴斯德點(diǎn)(Pasteur point)，即氧分壓達(dá)到當(dāng)前大氣氧分壓水平(PAL)的1%(大約相當(dāng)于94 μmol/L)，是歷史上好氧微生物和厭氧微生物生長(zhǎng)的分界點(diǎn)[1,2]。但Baughn等發(fā)現(xiàn)厭氧菌Bacteroides fragilis利用nmol/L級(jí)的氧氣生長(zhǎng)[3]。這類(lèi)厭氧菌被定義為“納級(jí)厭氧菌(Nanaerobe)”[3]。Stolper等發(fā)現(xiàn)某些好氧微生物也可以在氧氣濃度<3 nmol/L條件下生長(zhǎng)[4]。嚴(yán)格厭氧微生物對(duì)氧氣的適應(yīng)和生長(zhǎng)耐受機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

　　氧氣在細(xì)胞內(nèi)能以氧自由基(O2/ROS)的形式存在，如O2-·、H2O2、·OH和1O2，微生物細(xì)胞除了產(chǎn)生抗壞血酸和谷胱氨肽等小分子的抗氧化劑外，也可以產(chǎn)生抗氧化酶來(lái)消除氧自由基的脅迫，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗氧化蛋白(PXs)[6]。McCord等認(rèn)為嚴(yán)格厭氧微生物不含有超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶活性(CAT)，而耐氧微生物則能利用超氧化合物氧化酶(SOR)抵御一定濃度的氧脅迫[7]。但是S′lesak等分析了100種嚴(yán)格厭氧微生物，發(fā)現(xiàn)93%的菌種中至少含有一種抗氧化酶[6]。從能量代謝的角度，厭氧微生物無(wú)法利用氧氣作為末端電子受體獲取ATP，只能通過(guò)底物水平磷酸化，或者利用硫酸鹽等外源電子受體進(jìn)行厭氧呼吸獲得能量[8]。好氧微生物通過(guò)呼吸鏈傳遞電子并獲取ATP，其中氧化酶作為關(guān)鍵功能酶，一度也被認(rèn)為是好氧微生物獨(dú)有的特征酶。Baughn等發(fā)現(xiàn)厭氧菌利用細(xì)胞色素bd氧化酶(cytochrome bd oxidase)利用nmol/L級(jí)的氧氣生長(zhǎng)[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)很多嚴(yán)格厭氧菌，如Archaeoglobus fulgidus、Desulfovibrio gigas、Methanosarcina barkeri和Moorella thermoacetica都含有類(lèi)似的細(xì)胞色素bd氧化酶編碼基因，可能都具有類(lèi)似的低氧代謝能力[3,9,10]。因此，通過(guò)厭氧微生物基因組中是否含有抗氧化酶和氧化酶基因，也難以準(zhǔn)確區(qū)分它們是否屬于厭氧微生物[1]。

　　1 厭氧微生物培養(yǎng)分離的研究歷史

　　早在300多年前，Antoni van Leeuwenhoek在靜置培養(yǎng)三周后的胡椒水中，觀察到有活的微生物存在，這是***早關(guān)于厭氧微生物培養(yǎng)的報(bào)道[11]。十九世紀(jì)六十年代，法國(guó)科學(xué)家Louis Pasteur開(kāi)啟了厭氧微生物學(xué)研究，***根據(jù)微生物是否可以在有氧條件下生長(zhǎng)，將微生物劃分為好氧和厭氧微生物[12]。此外，他和合作者分離獲得了***個(gè)致病性厭氧菌，后被命名為Clostridium septicum [12]。巴斯德提出的煮沸或抽真空法制備預(yù)還原厭氧培養(yǎng)基是經(jīng)典的厭氧操作技術(shù)之一。

　　在Hungate厭氧操作技術(shù)發(fā)明以前，科學(xué)家通常通過(guò)生物法(如共培養(yǎng)好氧細(xì)菌的方式消耗培養(yǎng)基中的氧氣)、物理法(如煮沸、抽真空、惰性氣體吹掃)和化學(xué)法(如添加鐵、硫化物和堿性焦棓酸)等制備預(yù)還原培養(yǎng)基[13]。在厭氧培養(yǎng)的時(shí)候，通常是采用深層瓊脂/液體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋培養(yǎng)，并結(jié)合液封(如石蠟、原油、綿羊油、凡士林)，或者橡膠塞、密封罐等方式密封[13,14]。這些操作繁瑣、難以真正隔絕氧氣，而且在挑取深層單菌落的過(guò)程中也容易被污染。這導(dǎo)致厭氧微生物研究進(jìn)展緩慢，只能分離一些產(chǎn)芽孢厭氧菌、兼性厭氧菌或耐氧菌，如Clostridium[15,16]。

　　1947年，美國(guó)微生物學(xué)家Robert E. Hungate通過(guò)深層瓊脂法分離厭氧纖維素降解菌的時(shí)候，意外發(fā)現(xiàn)管內(nèi)壁上層的薄層固體培養(yǎng)基上會(huì)形成單菌落[17]。隨后他提出了滾管法分離厭氧菌的操作技術(shù)[18]，經(jīng)過(guò)不斷的完善[19]，該方法已成為厭氧微生物分離培養(yǎng)的經(jīng)典方法[20]。該技術(shù)核心有3點(diǎn)：利用完全密封的玻璃管培養(yǎng)厭氧微生物;利用高溫銅柱去除惰性氣體中的殘余氧，在無(wú)氧惰性氣體保護(hù)下制備預(yù)還原培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)移厭氧微生物;利用滾管法制備貼內(nèi)壁的固定培養(yǎng)基薄層，生長(zhǎng)的單菌落很容易被挑取轉(zhuǎn)移[18,20]。這個(gè)操作技術(shù)所需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，并能提供嚴(yán)格厭氧環(huán)境，是厭氧微生物分離的經(jīng)典方法。Hungate在厭氧微生物學(xué)領(lǐng)域的奠基性工作，使其成為厭氧微生物學(xué)研究的先驅(qū)[21,22]。同時(shí)期有科學(xué)家開(kāi)發(fā)了封閉的充滿(mǎn)無(wú)氧氣體的手套箱，實(shí)驗(yàn)人員可以通過(guò)手套進(jìn)行厭氧操作[23,24]，這種方法雖然比Hungate厭氧操作技術(shù)簡(jiǎn)單，但是手套箱中的殘氧含量還是高于厭氧管，早期的厭氧手套箱無(wú)法控制潔凈度，容易造成交叉污染，也難以大面積的推廣使用。我們課題組與企業(yè)聯(lián)合開(kāi)發(fā)的無(wú)菌無(wú)氧控溫手套箱，氧含量***低小于10 mg/L，內(nèi)部操作空間可以達(dá)到百級(jí)潔凈，溫度可以控制在10-25 ℃，適宜開(kāi)展大規(guī)模的無(wú)菌操作[25]。

　　1977年，Carl R. Woese提出“三域?qū)W說(shuō)”，根據(jù)核糖體基因序列相似度來(lái)指示物種親緣關(guān)系的理論后[26]，完全改變了人們對(duì)微生物物種多樣性的認(rèn)知。在DNA測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，科學(xué)家推測(cè)全球微生物數(shù)量達(dá)到了1030的量級(jí)，其中超過(guò)70%分布在陸相和海相深部缺氧沉積物中[27,28]，這表明地球上的微生物仍然以厭氧微生物為主，其物種多樣性可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)好氧微生物。這也表明厭氧微生物資源是尚未充分開(kāi)發(fā)的一塊處女地，值得微生物資源與分類(lèi)學(xué)家去關(guān)注。

　　2 厭氧微生物培養(yǎng)分離新策略

　　2.1 限制厭氧微生物培養(yǎng)分離的因素

　　微生物分離的經(jīng)典思路是“先富集后分離”，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基讓特定功能的微生物繁殖變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌，重復(fù)在固體或液體培養(yǎng)基上梯度稀釋培養(yǎng)，以純化獲取單菌落。這種傳統(tǒng)思路的局限性也非常明顯：(1)分離過(guò)程的盲目性：環(huán)境中存在大量未培養(yǎng)微生物，但是不知道哪些微生物會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程被選擇性富集。(2)分離的隨機(jī)性：不同種類(lèi)的環(huán)境微生物濃度可能相差3-5個(gè)數(shù)量級(jí)[29,30]。即使假定所有微生物都可以培養(yǎng)生長(zhǎng)，理論上也需要隨機(jī)挑取數(shù)百萬(wàn)級(jí)別的單菌落，才有可能分離到所有的微生物。而傳統(tǒng)Hungate滾管法的分離通量很難超過(guò)2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，難以挑取到所有微生物。(3)菌株生長(zhǎng)的不確定性：人工設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件無(wú)法滿(mǎn)足所有原位微生物的生長(zhǎng)。如磷酸鹽緩沖液與瓊脂高溫濕熱滅菌后，會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)[31]。有些微生物的菌體生長(zhǎng)濃度只有105個(gè)/ml甚至更低，難以通過(guò)選擇培養(yǎng)的方式進(jìn)行富集[32]。(4)菌株生理特征的未知性：厭氧微生物不僅生長(zhǎng)緩慢，對(duì)氧氣敏感，而且存在更為復(fù)雜的種間互作關(guān)系，如互營(yíng)微生物依賴(lài)于產(chǎn)甲烷古菌的互營(yíng)代謝關(guān)系[33]。如果不清楚這些未培養(yǎng)微生物的生理特征，也難以分離培養(yǎng)它們。

　　2.2 提高厭氧微生物培養(yǎng)分離的策略

　　鑒于厭氧微生物的特殊生理特征，我們總結(jié)國(guó)內(nèi)外分離厭氧微生物的研究策略，主要通過(guò)測(cè)序引導(dǎo)分離、開(kāi)發(fā)新裝置提高分離效率、改善培養(yǎng)條件、預(yù)測(cè)未培養(yǎng)微生物的潛在代謝功能等策略，來(lái)提高厭氧微生物的分離效率(表2)。

　　2.2.1 通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)等解決厭氧微生物分離過(guò)程的盲目性：

　　通過(guò)微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，實(shí)時(shí)跟蹤不同處理和培養(yǎng)條件下目標(biāo)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，降低厭氧菌分離的盲目性。Sekiguchi等采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)監(jiān)測(cè)厭氧絲菌UN1-1的分離，后被鑒定為新屬Anaerolinea [34,35]。類(lèi)似的，Sakai設(shè)計(jì)產(chǎn)甲烷古菌RC-I的探針，用于指導(dǎo)產(chǎn)甲烷古菌新目Methanocella的分離[36]。Ma等在16S rRNA基因序列的引導(dǎo)下，結(jié)合滑動(dòng)微流控芯片技術(shù)分離獲得Ruminococcaceae的一個(gè)新屬[37]。利用MALDI-TOF技術(shù)分析菌株核糖體蛋白的差異特征[38,39]，菌株鑒定通量可以達(dá)到幾百個(gè)菌株/小時(shí)，并能鑒定到種或?qū)偎剑@樣能降低后續(xù)50-80%的工作量。Witkowska等通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼光譜譜技術(shù)可以識(shí)別菌株水平的微生物[40]。Bellais等通過(guò)特異性多克隆抗體反應(yīng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀識(shí)別和分選出來(lái)腸道Faecalibacterium prausnitzii[41]。

　　2.2.2 開(kāi)發(fā)新裝置和設(shè)備提高厭氧微生物分離的通量：

　　隨著高通量培養(yǎng)裝備和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，將單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)微生物細(xì)胞分散到單孔中，也可以進(jìn)行“先分離后富集”。開(kāi)發(fā)厭氧微生物高通量分離培養(yǎng)裝置，降低“培養(yǎng)瓶”的容積，可以提高微生物的分離效率。有科學(xué)家利用96或384微孔板，將培養(yǎng)體積降低到100-200 μL，相應(yīng)的，“培養(yǎng)瓶”的數(shù)量能提高到數(shù)千個(gè)量級(jí)[32,42]。微流控技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步將培養(yǎng)孔的體積降低到nL甚至pL尺度。Ma等設(shè)計(jì)的微流控滑動(dòng)芯片有3200個(gè)微孔能用于微生物培養(yǎng)，每孔容積只有6 nL左右[37]。Villa等應(yīng)用微流控液滴技術(shù)，在厭氧手套箱中分離腸道厭氧微生物[43]。Ingham等構(gòu)建的半透性芯片，***高可以布置近百萬(wàn)個(gè)芯片微孔，一次性可以掃描20多萬(wàn)個(gè)單菌[44]。Zengler等利用低濃度瓊脂包裹的凝膠微囊，可以在流動(dòng)性培養(yǎng)液中培養(yǎng)單菌[45]。

　　2.2.3 通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件改善厭氧微生物的可培養(yǎng)性：

　　添加伴生菌可以促進(jìn)厭氧微生物的生長(zhǎng)。如互營(yíng)微生物是一類(lèi)獨(dú)特厭氧微生物，需要伴生菌消耗氫氣并維持低氫分壓才能生長(zhǎng)。Qiu等通過(guò)添加外源氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，分離獲得了互營(yíng)苯酚降解菌新屬Syntrophorhabdus[46]。同時(shí)，他們課題組反其道而行之，通過(guò)互營(yíng)丙酸降解菌產(chǎn)生的低濃度氫氣，來(lái)“釣取”水稻根際甲烷排放的重要未培養(yǎng)產(chǎn)甲烷古菌新目Methanocellales[36,47]。Huber等發(fā)現(xiàn)嗜熱古菌新門(mén)Cadidaus Nanoarchaeota依賴(lài)于嗜熱化能自養(yǎng)古菌Ignicoccus才能生長(zhǎng)[48]。Carbonero等發(fā)現(xiàn)難以在普通瓊脂培養(yǎng)上生長(zhǎng)的產(chǎn)甲烷古菌Methanothrix(原屬名Methanosaeta)，可以在0.3%結(jié)冷膠培養(yǎng)基上形成菌落[49]。國(guó)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液與瓊脂分開(kāi)滅菌后可以提高微生物的可培養(yǎng)性[31,49]，我們研究也發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液會(huì)增加乙酸代謝產(chǎn)甲烷的延滯期，降低古菌群落的多樣性[50]。添加抗生素選擇性抑制厭氧微生物[51]，添加乙醇獲得產(chǎn)芽孢的厭氧菌[30]，添加硫酸鹽、鐵錳氧化物作為電子受體，或添加不同的還原劑，如檸檬酸鈦和抗壞血酸鈉，也可以選擇性富集不同類(lèi)型的厭氧還原菌[29,52,53]。這些都可以提高厭氧微生物新物種的分離概率[52,53]。此外，通過(guò)稀釋培養(yǎng)基、降低培養(yǎng)基成分的濃度[54,55]，在連續(xù)流反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)馴化培養(yǎng)[56,57]，也能分離獲得了厭氧微生物新種屬[57]。

　　2.2.4 通過(guò)宏組學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)未培養(yǎng)微生物的代謝功能：

　　高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，可以跳過(guò)微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié)，拼接獲得未培養(yǎng)微生物的全基因組序列，根據(jù)基因組序列特征推測(cè)它們的遺傳代謝潛力。如Evans等直接提取地下煤層水中的總DNA，通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)獲得了宏基因組序列，再根據(jù)GC含量、片段測(cè)序深度和四核苷酸多態(tài)性等序列特征，組裝拼接出2個(gè)未培養(yǎng)古菌的基因組序列。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因組中都含有依賴(lài)H2的甲基裂解產(chǎn)甲烷途徑的編碼基因，它們屬于Bathyarchaeota(深古菌門(mén))，而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的Euryarchaeota[58]。類(lèi)似的，在Verstraetearchaeota、Nezhaarchaeota、Korarchaeota和Thaumarchaeota等未培養(yǎng)新門(mén)中都發(fā)現(xiàn)了新型產(chǎn)甲烷古菌[59,60,61,62]。通過(guò)富集培養(yǎng)、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和中間代謝產(chǎn)物分析，能發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)微生物的代謝新功能，如完全硝化細(xì)菌、降解短鏈烷烴的硫酸鹽還原細(xì)菌和古菌等[54,63,64,65]。標(biāo)記培養(yǎng)和顯微成像技術(shù)，如CARD-FISH和NanoSIMS結(jié)合，可以在單細(xì)胞水平鑒別未培養(yǎng)古菌的碳代謝功能。Chen等發(fā)現(xiàn)古菌Ca. Argoarchaeum細(xì)胞內(nèi)的硫含量顯著高于其它硫酸鹽還原菌，推測(cè)原位硫酸鹽還原降解乙烷主要發(fā)生在古菌而不是細(xì)菌細(xì)胞中[65]。

　　由于微生物物種的多樣性和生理特征的異質(zhì)性，難以通過(guò)單一的策略和方法分離所有的微生物。組合多種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，進(jìn)行高通量分離篩選的“培養(yǎng)組學(xué)”應(yīng)運(yùn)而生[39,66]。如Lagier等嘗試了212種培養(yǎng)條件，從12個(gè)糞便樣品中分離挑取了90萬(wàn)個(gè)單菌落，結(jié)合MALDL-TOF和16S rRNA基因測(cè)序，共獲得了1057種微生物(其中新種以上的分類(lèi)單元近200個(gè))[39]。另外，Imachi等通過(guò)連續(xù)流馴化、共培養(yǎng)降低氫分壓、低濃度生長(zhǎng)和特異性序列監(jiān)測(cè)的“雞尾酒”法(綜合多種分離策略和方法)，并努力和堅(jiān)持?jǐn)?shù)十年，分離出厭氧古菌新門(mén)Asgard的純培養(yǎng)物[67]。該研究可能會(huì)改寫(xiě)生命起源與進(jìn)化認(rèn)知[68]。Cross等通過(guò)宏基因組或單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)獲得未培養(yǎng)微生物的基因組序列，并預(yù)測(cè)未培養(yǎng)微生物的膜蛋白基因預(yù)測(cè)抗原表位，通過(guò)制備特異性的標(biāo)記抗體，來(lái)特異性結(jié)合并篩選目標(biāo)細(xì)菌，從而進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)[69]。如果這個(gè)技術(shù)具有普適性，那么將突破活體微生物細(xì)胞的定向預(yù)分離技術(shù)，為后續(xù)的分離和原位生理功能研究奠定基礎(chǔ)。

　　3 已分離厭氧微生物的物種多樣性

　　截止本文修訂時(shí)，全球有效發(fā)表的原核微生物(具有正確的拉丁文名)只有17304個(gè)種，分別屬于38門(mén)、73綱、213目、52科，3563屬(截止2020-8-15，https://lpsn.dsmz.de/text/numbers)，其中厭氧微生物只有2151個(gè)種，低于好氧微生物一個(gè)數(shù)量級(jí)?？茖W(xué)家推測(cè)原核微生物的種水平多樣性可能高達(dá)106–1012個(gè)[71,72,73,74]。因此，從全球尺度看可培養(yǎng)微生物比例不超過(guò)1%，其中厭氧純培養(yǎng)物的可培養(yǎng)度不及0.1%，絕大部分厭氧微生物處于未培養(yǎng)狀態(tài)。

　　上世紀(jì)80年代，我國(guó)科學(xué)家就開(kāi)始開(kāi)展厭氧微生物的分離培養(yǎng)，特別是產(chǎn)甲烷古菌的分離培養(yǎng)研究[75,76,77,78,79,80]。直到2003年，我國(guó)科學(xué)家(***作者或通訊作者單位為國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu))才***正式提出厭氧微生物新物種Alkaliphilus crotonatoxidans[81]。截止2020年8月，國(guó)內(nèi)科學(xué)家共提出92個(gè)新種，分布于11門(mén)、18綱、29目、47科、71屬(表3)。其中，穆大帥等發(fā)表的新綱Tichowtungiia是目前我國(guó)科學(xué)家提出的厭氧微生物的***高分類(lèi)單元[82]。另外，我國(guó)科學(xué)家還提出了2個(gè)新目(Thermosediminibacterales和Moorellales)、9個(gè)新科，除中山大學(xué)李文均課題組提出的新科Xylanivirgaceae外[83]，其它均由我們課題組提出[84,85,86]。在92個(gè)新種中，只有9個(gè)屬于古菌域，其中7個(gè)屬于廣古菌門(mén)，主要由東秀珠研究員和我們課題組提出，東老師課題組發(fā)現(xiàn)乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌新種Methanothrix harundinacea[87]，后被證實(shí)具有利用電子還原二氧化碳產(chǎn)甲烷的功能[88]。我們課題組發(fā)現(xiàn)的甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌新科Methermicoccaceae[85]，后被證實(shí)具有直接降解煤炭中氧甲基化合物產(chǎn)甲烷的功能[89]。

　　由于厭氧微生物生長(zhǎng)條件苛刻，對(duì)保藏技術(shù)和設(shè)施要求較高。厭氧微生物模式物種資源主要保藏在德國(guó)、美國(guó)和日本(表4)。其中，德國(guó)DSMZ收集保藏的厭氧微生物模式物種達(dá)到了1896個(gè)，是國(guó)際上***大的厭氧微生物模式物種保藏機(jī)構(gòu)。在2003年啟動(dòng)的科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目的資助下。我國(guó)厭氧微生物資源保藏工作開(kāi)始起步，國(guó)內(nèi)已保藏厭氧微生物1663株，模式物種515個(gè)(表5，不同保藏中心可能存在相同物種)。依托農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所的中國(guó)厭氧微生物資源管理中心(前身為農(nóng)業(yè)部厭氧微生物重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室)，是國(guó)際菌種聯(lián)盟(WFCC)的會(huì)員單位，具備新物種的保藏資質(zhì)，目前保藏厭氧微生物模式菌株334種，產(chǎn)甲烷古菌45種，厭氧微生物模式物種保藏量國(guó)內(nèi)***，在國(guó)際上排名第四)。

　　4 未來(lái)展望

　　在上世紀(jì)60年代，知名微生物學(xué)家Roger Stanier悲觀的認(rèn)為“對(duì)細(xì)菌分類(lèi)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的科學(xué)目標(biāo)”[177]。但是Carl R. Woese根據(jù)核酸序列相似性提出的“三域?qū)W說(shuō)”理論，近乎完美的解決了微生物的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)問(wèn)題[26]?；谶@個(gè)思路揭示了地球上豐富的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)了海量的“微生物暗物質(zhì)”[28,178]。這奠定了現(xiàn)代環(huán)境微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，并開(kāi)創(chuàng)了微生物分子生態(tài)學(xué)研究。當(dāng)然，新認(rèn)知也產(chǎn)生新的科學(xué)問(wèn)題——微生物數(shù)量高達(dá)1030次方，物種數(shù)可能超過(guò)百萬(wàn)級(jí)的“微生物暗物質(zhì)”，是否可以被分離培養(yǎng)?。筆者長(zhǎng)期從事厭氧微生物資源與系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究，過(guò)去我們分離厭氧微生物，主要基于生理和形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合多種手段去分離。例如，我們富集獲得了65℃條件下降解甲醇產(chǎn)甲烷的富集培養(yǎng)物，但是沒(méi)有如此高溫甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的報(bào)道。因此，我們選擇采用Hungate固體滾管技術(shù)，并降低到55℃培養(yǎng)1-2個(gè)月后挑取單菌落。從而順利分離并鑒定到Methermicoccus shengliensis ZC-1[85]。后來(lái)采用先“分離”后“培養(yǎng)”的思路，先將菌液分分散到微孔中，再?lài)L試添加不同類(lèi)型的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，也先后獲得了多個(gè)新屬[86,155]。但是，如果采用這些傳統(tǒng)思路和方法，根據(jù)全球新物種的分離鑒定速度(102-3量級(jí)/年)來(lái)推測(cè)，那么似乎這又是“無(wú)法實(shí)現(xiàn)的科學(xué)目標(biāo)”。